Entre los países que conforman el llamado punto caliente de biodiversidad o hot spot del Caribe se encuentra Cuba, lo cual es producto del alto número de especies de plantas y animales que en ella habitan (Myers et al., 2000Myers, N., R.A. Mittermeier, C.G. Mittermeier, G.A. Da Fonseca, y J. Kent. 2000. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403(6772): 853.). Entre los grupos de animales presentes en el archipiélago cubano se destacan los anfibios con 68 especies (66 de las cuales son endémicas) (Alonso y García, 2017Alonso-Bosch, R. y L.Y. García-Padrón. 2017. Anfibios. Pp. 348-375. En: Diversidad biológica de Cuba: métodos de inventario, monitoreo y colecciones biológicas (C.A. Mancina y D.D. Cruz, Eds.). Editorial AMA, La Haban, 502 pp.). Peltophryne es uno de los géneros que conforman este grupo y cuenta con 12 especies. Se distribuyen en las Antillas mayores e islas Vírgenes Británicas (Pregill, 1981Pregill, G. 1981. Cranial morphology and the evolution of West Indian toads (Salientia: Bufonidae): resurrection of the genus Peltophryne Fitzinger. Copeia 1981: 273-285.). Del total de especies, 8 son exclusivamente cubanas (Alonso et al., 2012Alonso, R., A.J. Crawford y E. Bermingham. 2012. Molecular phylogeny of an endemic radiation of Cuban toads (Bufonidae: Peltophryne) based on mitochondrial and nuclear genes. Journal of Biogeography 39(3): 434-451.).

Se han realizado estudios sobre la biología reproductiva de otros miembros del género en Cuba, ya sea la espermatogénesis (Sanz et al., 2007Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, L.F. Jimenez y M. Iturriaga. 2007. Gametogenesis in cuban amphibians. Acta Microscopica 16 (1-2) suplemento 2: 1-2.), la morfología de las gónadas (Sanz et al., 2008Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2008. Estructura y ultraestructura de la gónada de los machos de Bufo fustiger (Anura: Bufonidae). TIP. Revista especializada en ciencias químico-biológicas 11(2): 81-86.) o sobre el órgano de Bidder (Sanz, 2015Sanz A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2015. El órgano de Bidder en sapos (Peltophryne spp.) endémicos de Cuba. Aspectos morfológicos y de ultraestructura. Revista Cubana de Ciencias Biológicas 4(1): 78-88.). Sin embargo, no se ha hecho ningún estudio relacionado con la biología reproductiva de P. empusa excepto por la descripción de su metamorfosis en condiciones de laboratorio (Kidov et al., 2017Kidov A.A., K.A. Matushkina, S.A. Blinova y K.A. Afrin. 2017. Laboratory Reproduction of the Cuban Toad, Peltophryne empusa (Cope, 1862). Current Studies in Herpetology 17: 36-43). Por esto es necesario la realización de estudios sobre la biología reproductiva, pues puede brindar información útil para la conservación de la especie. Además, se conoce poco sobre la función de órgano de Bidder, una estructura similar a un ovario presente mayoritariamente en los machos de la familia Bufonidae, así como en algunas hembras (Piprek et al., 2014Piprek, R. P., M. Klo y J.Z. Kubiak. 2015. Bidder’s organ-structure, development and function. International Journal of Developmental Biology 58(10-11-12): 819-827.). Sin embargo, se sabe que, si son extirpados los testículos, este órgano deriva en un ovario (Harms, 1921Harms, J.W. 1921. Verwandlung des Bidderschen Organs in ein Ovarium beim Mánnchen von Bufo vulgaris Laur. Zoologischer Anzeiger 53: 253-265.; Browns et al., 2002Brown, F.D., E.M. Del Pino y G. Krohne. 2002. Bidder's organ in the toad Bufo marinus: effects of orchidectomy on the morphology and expression of lamina‐associated polypeptide 2. Development, growth & differentiation 44(6): 527-535.). Además, se piensa que puedan presentar función endocrina (Abramyan, 2010Abramyan, J., D. Wilhelm y P. Koopman. 2010. Molecular characterization of the Bidder's organ in the cane toad (Bufo marinus). Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution 314(6): 503-513.). Es por ello que el objetivo de este trabajo es realizar una descripción macro y microscópica de las gónadas de P. empusa.

Los ejemplares de P. empusa fueron recolectados en la Finca San Paúl (22,9303°N; 82,45731°W), una localidad perteneciente al municipio San Antonio de los Baños, provincia Artemisa, Cuba. Estas colectas se llevaron a cabo durante el período 2018-2019, donde obtuvieron un total de dos ejemplares machos y cuatro hembras.

Los ejemplares fueron posteriormente llevados al laboratorio donde se anestesiaron mediante una solución de dietiléter al 99 %. Posteriormente se procedió a medirlos, desde la punta del hocico hasta la cloaca mediante un pie de rey con un error de 0,01 mm, y a pesarlos mediante una balanza con un error de 0,5 g. Una vez hecho esto se diseccionaron y se les extrajeron las gónadas (en caso de los machos) o partes de ellas (en caso de las hembras).

Las muestras fueron entonces fijadas en soluciones de formaldehído al 4 % y de glutaraldehído al 2,5 % para ser procesadas por técnicas histológicas para microscopías óptica y electrónica, respectivamente. Luego, en el caso de las muestras para ser analizadas mediante microscopía óptica, pasaron a ser teñidas con hematoxilina-eosina y con la técnica tricrómica de Mallory. En el caso de las muestras para microscopía electrónica se tiñeron mediante azul de toluidina y acetato de uranilo y citrato de plomo.

Los cortes histológicos fueron observados mediante un microscopio óptico Novel a 4x, 10x y 40x. En el caso de los cortes para microscopía electrónica, se empleó un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM.

Machos: Los ejemplares machos presentaron un par de gónadas situadas bajo las vísceras y encima de los riñones. Eran alargadas y estaban compuestas por un testículo y un órgano de Bidder situado en posición cefálica. Sólo se detectaron cuerpos grasos en la época seca, los cuales eran amarillos y de aspecto digitiforme. Los testículos eran no pigmentados y muy lobulados, dichos lóbulos podían estar hasta separados del testículo principal sin que hubiera tejido adiposo que los uniera (Fig.1A). El órgano de Bidder era redondeado y pequeño en comparación con el testículo y su superficie era irregular debido a los ovocitos presentes.

Bajo el microscopio óptico, las gónadas estaban divididas entre órgano de Bidder y testículo por una capa de tejido conectivo. El órgano de Bidder poseía una cantidad abundante de tejido adiposo, de forma tal que los ovocitos estaban desplazados hacia uno de los lados y dispuestos en una hilera. El testículo contenía túbulos seminíferos delimitados por tejido conectivo, así como cistos donde ocurría la espermatogénesis (Fig. 1B).

Los ovocitos presentes en el órgano de Bidder se encontraban en fase previtelogénica con muchos nucléolos (de 2 - 24) en el núcleo (Fig.1C). Se encontraron también cuerpos atrésicos. En cuanto al testículo, los cistos se encontraban en distintas fases de la espermatogénesis, de forma independiente, no continua, como en la espermatogénesis radial de los amniotas. Aunque predominaban los espermatozoides y las espermátidas (tempranas, medias y tardía), así como células de Sertoli y células de tejido conectivo (Fig.1D). De manera general, en ambas estaciones del año se encontraron espermatozoides y espermátidas en las gónadas, aunque en la temporada seca fueron mucho menos numerosos.

En las muestras para microscopio electrónico se observó que los espermatozoides estaban formados por una cabeza y una cola, aunque se encontró uno con dos colas (Fig. 1E). La cabeza era alargada y elíptica, con un extremo aguzado y estaba formada por el núcleo compactado de cromatina, un espacio subacrosómico y el acrosoma. La cola poseía una membrana ondulante y estaba compuesta por nueve pares periféricos y un par central de microtúbulos. También se observaron espermátidas en formación rodeadas por el citoplasma de las células de Sertoli, las cuales poseían numerosas mitocondrias (Fig. 1F).

Hembras: Las hembras se encontraron con la cavidad abdominal repleta de ovocitos (cubrían toda la cavidad abdominal) en ambas estaciones del año. No se encontró el órgano de Bidder ni se observó una división entre ambos ovarios. Los ovocitos estaban pigmentados por el polo animal, mientras que el polo vegetal poseía vitelo y era de color blanco amarillento. Sólo se encontraron cuerpos grasos en una hembra durante la temporada seca, los cuales tenían el mismo aspecto que los hallados en los machos.

Vistos bajo el microscopio óptico, en ambas épocas del año se encontraron ovocitos vitelogénicos y previtelogénicos. También se observaron lechos germinales situados en la periferia de los ovarios y una leve cavidad central (Fig. 2A) así como cuerpos atrésicos. Los ovocitos presentaban una gran cantidad de vitelo en el polo vegetativo, mientras que el polo animal estaba pigmentado (Fig. 2B) y se encontraban rodeados por dos capas: una membrana vitelina y una capa de células foliculares (Fig. 2C). Los núcleos poseían nucléolos y cromosomas en escobilla (lampbrush) (Fig. 2D). Bajo el microscopio electrónico se observó el complejo de Golgi (Fig. 2E), las mitocondrias (Fig. 2F) y los complejos de unión (Fig. 2G).

Las características presentes en las gónadas masculinas de Peltophryne empusa son similares a las encontradas en otros sapos: cubanos como P. fustiger (Sanz et al., 2007Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, L.F. Jimenez y M. Iturriaga. 2007. Gametogenesis in cuban amphibians. Acta Microscopica 16 (1-2) suplemento 2: 1-2.), P. gundlachii y P. cataulaciceps (Sanz et al., 2015Sanz A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2015. El órgano de Bidder en sapos (Peltophryne spp.) endémicos de Cuba. Aspectos morfológicos y de ultraestructura. Revista Cubana de Ciencias Biológicas 4(1): 78-88.) y extranjeros como Rhinella marina (Brown et al., 2002Brown, F.D., E.M. Del Pino y G. Krohne. 2002. Bidder's organ in the toad Bufo marinus: effects of orchidectomy on the morphology and expression of lamina‐associated polypeptide 2. Development, growth & differentiation 44(6): 527-535.) y Bufo lentiginosus (King, 1908King, H.D. 1908. The structure and development of Bidder's organ in Bufo lentiginosus. Journal of Morphology 19(2): 439-468.). El hecho de haber hallado el órgano de Bidder en posición cefálica del testículo indica que esta especie pertenece al tipo II según la clasificación de Piprek et al. (2014)Piprek, R. P., M. Klo y J.Z. Kubiak. 2015. Bidder’s organ-structure, development and function. International Journal of Developmental Biology 58(10-11-12): 819-827..

El hecho de que el testículo sea alargado lo hace similar a P. gundlachii (Sanz et al., 2015Sanz A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2015. El órgano de Bidder en sapos (Peltophryne spp.) endémicos de Cuba. Aspectos morfológicos y de ultraestructura. Revista Cubana de Ciencias Biológicas 4(1): 78-88.), la presencia de lóbulos lo asemeja a P. peltocephala (Sanz et al., 2015Sanz A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2015. El órgano de Bidder en sapos (Peltophryne spp.) endémicos de Cuba. Aspectos morfológicos y de ultraestructura. Revista Cubana de Ciencias Biológicas 4(1): 78-88.) aunque el encontrarse completamente separado del testículo es único en esta especie, puesto que los lóbulos de P. peltocephala están unidos a los testículos mediante tejido conectivo. El haberse encontrado tejido adiposo en el órgano de Bidder sólo ha sido encontrado en P. taladai (Sanz-Ochotorena et al., 2019Sanz Ochotorena, A. C., Y. Rodríguez Gómez, M. de L. Segura-Valdez, R. Lara Martínez y L. F. Jiménez García. 2019. Atlas de la morfología microscópica de las gónadas de anfibios y reptiles de Cuba. La Habana, Editorial UH. 176 pp.). En cuanto a los cortes histológicos, la organización de los tejidos es similar a la hallada en otras especies de anuros cubanos tanto de las ranitas (Eleutherodactylus atkinsi, E. goini, E. planirostris, E. riparius, E. varleyi y E. zugi) (Rodríguez et al., 2015Rodríguez, Y., A.S. Ochotorena, M.D.L.S. Valdés y R. Lara. 2015. Gametogenesis Stages of Cuban Eleutherodactylus Frogs Revealed by TEM Studies. [Inédito]. 2 pp. ) como de los sapos P. fustiger (Sanz et al., 2008Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2008. Estructura y ultraestructura de la gónada de los machos de Bufo fustiger (Anura: Bufonidae). TIP. Revista especializada en ciencias químico-biológicas 11(2): 81-86.).

Se observaron tres características que pueden indicar una posición intermedia de esta especie entre los grupos de bufónidos cubanos: pequeños y grandes. Aunque tal parece que esté más emparentado, por una mayor cantidad de similitudes, con los sapos grandes como menciona Alonso et al., (2012)Alonso, R., A.J. Crawford y E. Bermingham. 2012. Molecular phylogeny of an endemic radiation of Cuban toads (Bufonidae: Peltophryne) based on mitochondrial and nuclear genes. Journal of Biogeography 39(3): 434-451.. Esas tres características son: 1- Testículos no pigmentados, como en P. fustiger (Sanz et al., 2008Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2008. Estructura y ultraestructura de la gónada de los machos de Bufo fustiger (Anura: Bufonidae). TIP. Revista especializada en ciencias químico-biológicas 11(2): 81-86.), el cual es un sapo del grupo de los grandes; 2- Presencia de membrana ondulante en las colas de los espermatozoides (como en los sapos pequeños); 3- Existencia de espermatozoides con dos colas, como en P. fustiger (Sanz et al., 2008Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2008. Estructura y ultraestructura de la gónada de los machos de Bufo fustiger (Anura: Bufonidae). TIP. Revista especializada en ciencias químico-biológicas 11(2): 81-86.).

La presencia de núcleos con nucléolos y cuerpos atrésicos en el órgano de Bidder se corresponde a lo encontrado en otras especies de bufónidos cubanos (Sanz et al., 2015Sanz A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura, R. Lara, y L.F. Jimenez. 2015. El órgano de Bidder en sapos (Peltophryne spp.) endémicos de Cuba. Aspectos morfológicos y de ultraestructura. Revista Cubana de Ciencias Biológicas 4(1): 78-88.) y foráneos (Farias et al., 2002Farias, C.F., S.P. Carvalho-e-Silva y L. de Brito-Gitirana. 2002. Bidder's organ of Bufo ictericus: a light and electron microscopy analysis. Micron 33(7-8): 673-679.). El hecho de que se encontraran nucléolos indica que el órgano de Bidder no es sólo una estructura anatómica, ya que estos se asocian principalmente con la biogénesis de los ribosomas (Boisvert et al., 2007Boisvert, F.M., S. van Koningsbruggen, J. Navascués y A.I. Lamond. 2007. The multifunctional nucleolus. Nature reviews Molecular cell biology 8 (7): 574.). Estos ribosomas son necesarios para la síntesis de la maquinaria requerida por el ovocito en la síntesis de proteínas (Gilbert, 2013Gilbert, S.F. 2013. Developmental Biology. Tenth Edition. Sinauer Associated Inc. 719 pp.). Los nucléolos pudieran también ayudar en la síntesis de ribosomas que permitan la síntesis de diversas enzimas necesarias para la producción de andrógenos y estrógenos (Scaia et al., 2011Scaia, M.F., E. Regueira, A.G. Sassone, M.C. Volonteri y N.R. Ceballos. 2011. The Bidder's organ of the toad Rhinella arenarum (Amphibia, Anura). Presence of steroidogenic enzymes. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology 315(8): 439-446.), o la conversión de pregnenolona o progesterona en 17-hidroxiprogesterona, testosterona, androstendiona, 17β-estradiol y estrona (Coolombo y Belvedere, 1980Colombo, L., y P.C. Belvedere. 1980. Steroid-hormone biosynthesis by male bidders organs of the toad Bufo Bufo (L). General and comparative endocrinology 40(3): 320-321.).

En cuanto a lo encontrado en las hembras, la ausencia de órgano de Bidder pudo haberse debido a la gran cantidad de ovocitos que estas presentaron, lo cual hizo difícil la búsqueda de esta estructura. La diferenciación entre el polo animal y vegetativo en cuanto al grado de pigmentación también se ha encontrado en otras especies de sapos cubanos como Peltophryne taladai (Sanz et al., 2010Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez y L.F. Jimenez. 2007 Ultrastructure of spermiogenesis in Bufo fustiger (Anura: Bufonidae). Acta Microscópica 16 (1-2) suplemento 2: 1-2. ) y foráneos como Rhinella scheideri (Montezol et al., 2017Montezol, M., M. Cassel, D. Silva, A. Ferreira y M. Mehanna. 2018. Gametogenesis and reproductive dynamics of Rhinella schneideri (Anura: Bufonidae): Influence of environmental and anthropogenic factors. Acta Zoologica 99(1): 93-104.), así como otros anuros como Rana tigerina (Sretarugsa et al., 2001Sretarugsa, P., W. Weerachatyanukul, J. Chavadej, M. Kruatrachue y P. Sobhon. 2001. Classification of developing oocytes, ovarian development and seasonal variation in Rana tigerina. Science Asia 27: 1-14.). Esta característica puede relacionarse con que dicha pigmentación protege el núcleo (que se encuentra en el polo animal) de la radiación ultravioleta.

Las características observadas en los ovocitos como los nucléolos, los cromosomas lampbrush, la capa de células foliculares, la membrana vitelina y la presencia de mitocondrias y complejo del Golgi en el citoplasma celular también han sido observadas en otros anfibios cubanos como P. fustiger, P. longinasa, P. peltocephala, Eleutherodactylus goini, E. riparius, E. cuneatus, E. zugi y E. caspari (Sanz et al., 2007Sanz, A., Y. Rodríguez, M. de L. Segura-Valdez, L.F. Jimenez y M. Iturriaga. 2007. Gametogenesis in cuban amphibians. Acta Microscopica 16 (1-2) suplemento 2: 1-2.). La presencia de numerosos nucléolos y cromosomas lampbrush en el núcleo, junto con la presencia de una gran cantidad de mitocondrias, podría deberse a la actividad sintética de los ovocitos. Estos se encuentran en el proceso de desarrollo para así prepararse para el posterior desarrollo del embrión una vez esté fecundado.

Es posible que la razón por la cual se encontró una gran cantidad de ovocitos a inicios de la temporada seca sea debido a las abundantes lluvias durante ese mes. Esto puede deberse a que P. empusa, sea una especie de sapo cuyo ciclo reproductivo sea discontinuo, típico de especies que habiten en regiones con estacionalidad (Montezol et al., 2027Montezol, M., M. Cassel, D. Silva, A. Ferreira y M. Mehanna. 2018. Gametogenesis and reproductive dynamics of Rhinella schneideri (Anura: Bufonidae): Influence of environmental and anthropogenic factors. Acta Zoologica 99(1): 93-104.), como en es el caso de Cuba, con temporada seca y lluviosa. Las especies de anfibios tropicales que viven en regiones con variaciones estacionales, normalmente poseen un ciclo reproductivo influenciado por las lluvias (Huang et al., 1996Huang, W.S., J.Y. Lin, y J.Y.L Yu. 1996. The male reproductive cycle of the toad, Bufo bankorensis, in Taiwan. Zoological Studies. 35: 128-137.; Pough et al., 2001Pough F.H., R.M. Andrews, J.E. Cadle, M.L. Crump, A.H. Savitzky, K.D. Wells. 2001. Reproduction and Life History. Pp 228-259 En: Herpetology. Prentice Hall New York. 726 pp.; Ferreira y Mehanna, 2012Ferreira A., y M. Mehanna. 2012. Seasonal testicular changes in Dendropsophus minutus Peters, 1872 (Anura, Hylidae). Biocell 36(2):57-62.).